α-酮戊二酸脫氫酶活性檢測試劑盒 微量法

α-酮戊二酸脫氫酶活性檢測試劑盒 微量法

貨號：BC0715

規格：100T/96S

產品內容：

試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體1mL×1支，-20℃保存；

試劑三：液體22mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑八：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加入0.8mL雙蒸水充分混勻待用，用不完的試劑仍-20℃保存。

工作液的配制：臨用前把試劑四、試劑五、試劑六、試劑七轉移到試劑三中混合溶解待用。

產品說明：

    α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物、植物微生物和培養細胞的線粒體中，是三羧酸循環調控關鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。

    α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀器和用品：

     紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、α-KGDH的提取

     稱取約0.1g組織或收集約500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑二，冰浴用勻漿器或研缽充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測。

α-酮戊二酸脫氫酶活性檢測試劑盒 微量法

二、測定步驟

• 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長340nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：

取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL試劑八和12μL蒸餾水，混勻并立即測量340nm處0s的吸光值A1，37℃準確反應2min，記錄340nm處2min時的吸光值A2，計算ΔA空白=A2-A1。

3.測定管：

取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL試劑八和12μL樣本，混勻并立即測量340nm處0s的吸光值A3，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）中準確反應2min，記錄340nm處2min時的吸光值A4，計算ΔA測定=A4-A3。

三、α-KGDH活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=1473.7×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDH（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1488.5×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T=2.977×(ΔA測定-ΔA空白)

V反總：反應體系總體積，2.2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.012 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=2456.2×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=2480.7×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=4.962×(ΔA測定-ΔA空白)

V反總：反應體系總體積，2.2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；V樣：加入樣本體積，0.012 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

注意事項：

• 測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。
• 比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
• 兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
• 測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。

?相關文獻：

《Inhibition of?α?ketoglutarate dehydrogenase activity afects adventitious root growth in?poplar via?changes in?GABA shunt》 作者:Jianyun?Yue,Changjian?Du,Jing?Ji,Tiantian?Xie, Wei?Chen,Ermei?Chang, Lanzhen?Chen, Zeping?Jiang,Shengqing?Shi
 期刊:Planta 影響因子:3.06 PMID:
《lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma》 作者:Xiao Li, Qi Zhao, Jianni Qi, Wenwen Wang ,Di Zhang ,Zhen Li, Chengyong Qin 期刊:International Journal of Oncology 影響因子:3.571 PMID:29845188
 

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運輸說明：

極低溫產品：極低溫產品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
低溫產品：低溫產品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
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